ERRORI DI PRELIEVO, CONSERVAZIONE E TRASPORTO DEI CAMPIONI

ERRORI DI PRELIEVO

Sono spesso e volentieri inevitabili, è doveroso comunque conoscerli perché incidono molto sull’esito finale del nostro esame

EMOLISI

Cause più comuni:

A. Traumatica:

Uso di siringhe ed aghi inadeguati (eccesso di “vuoto” e turbolenze)

Travaso in provetta con troppa foga o senza togliere l’ago

Eccessiva pressione negativa con sangue già in siringa

Eccessiva stasi durante il prelievo con siringa in pressione

Congelamento del sangue (attenzione al trasporto con “siberini”)

Centrifugazione eccessiva per durata e velocità

Surriscaldamento del sangue (problema estivo)

Eccesso di anticoagulante rispetto al sangue prelevato (in special modo quando si usa EDTA)

B. Lipemia

C. Contatto con:

Soluzioni ipotoniche

Soluzioni chimiche

Contatto con acqua anche di condensa

Uso improprio dei disinfettanti (anche alcol)

D. Ritardato invio al laboratorio senza tenere il campione in frigorifero

Conseguenze:

Gli spettrofotometri danno letture errate per lunghezze d’onda da 300 a 500 nm

In particolare ne risentono Sodio, Potassio, Calcio, Fosforo, Glucosio, Bilirubina, LDH, GOT, Lipasi e Urea

Nell’emocromo a parità di Emoglobina si avrà un numero di Globuli rossi ed un Ematocrito diminuiti, al contrario risulteranno essere più alti MCH e MCHC

SEMPRE E COMUNQUE PRIMA DI FARE UN PRELIEVO E’ BUONA NORMA AVERE TUTTO IL NECESSARIO A DISPOSIZIONE IMMEDIATA E NON ANDARLO A CERCARE DOPO IL PRELIEVO.

LIPEMIA

Abbiamo due tipi di Lipemia: esogena, dovuta alla dieta ed endogena legata al metabolismo epatico.

Possono essere grossolanamente distinte refrigerando per una decina di ore il plasma/siero; nella lipemia esogena tutti i grassi vengono in superficie lasciando il liquido sottostante limpido, cosa che invece non si verifica nella lipemia endogena.

Per evitare al massimo i problemi legati alla lipemia e necessario che il soggetto sia tenuto a digiuno per non meno di 5 ore, meglio ancora se 12 ore.

Negli Schnauzer nani talvolta nemmeno 12 ore sono sufficienti ed il digiuno dovrebbe protrarsi per lo meno per 2-3 giorni, cosa abbastanza improponibile …..

Alcuni autori consigliano in questo caso di sottoporre il soggetto ad una iniezione endovena di Eparina alla dose di 100-200 U.I./Kg e di effettuare il prelievo dopo 15 minuti.

La Lipemia può causare:

A. aumento dei valori di Proteine totali, Albumina, Glucosio, Bilirubina, Calcio, Fosforo, Emoglobina

B. diminuzione dei valori di: Sodio e Potassio

PAURA, ECCITAZIONE, APPRENSIONE

Per scarica adrenalinica possiamo avere:

Aumento generalizzato dei Globuli rossi, dell’Ematocrito e dell’Emoglobina

Neutrofilia senza deviazione a sinistra nel cane

Linfocitosi nel gatto giovane

Glicemia sino a 300-400 mg/dl in special modo nel gatto

Questo effetto adrenalinico permane all’incirca per una trentina di minuti, effettuando una sedazione / anestesia si ottengono risultati opposti, ma i due effetti possono anche sommarsi annullandosi.

CONSERVAZIONE SANGUE INTERO

Per effettuare un emogramma è necessario avere a disposizione sangue reso incoagulabile con  EDTA o Litio eparina.

Entrambi hanno pro e contro.

L’EDTA è l’anticoagulante d’elezione per gli emogrammi, conserva meglio la morfologia ematica e altera le piastrine in modo molto meno evidente.

Per contro però ha maggior facilità ad emolizzare e nel caso in cui si intenda usarlo per effettuare un Biochimico non consente l’esecuzione del Calcio, del Magnesio e della Fosfatasi alcalina poiché è un chelante del calcio.

Questa non è una differenza da poco perché spesso e volentieri i nostri animali non forniscono una tale quantità di sangue da consentire il riempimento di più provette.

In questo caso è meglio affidarsi al Litio Eparina come coagulante: con il plasma che si ottiene è possibile effettuare anche tutti i rilievi biochimici.

Per contro abbiamo una maggiore difficoltà nel mantenere la morfologia ematica e quasi costantemente una riduzione nel numero di piastrine contate (poco male, quella che vale sempre è la valutazione dello striscio che si fa al microscopio).

A proposito di striscio ematico, in un esame emocromocitometrico DEVE sempre esserci, altrimenti rischiamo brutte sorprese.

Il solito esempio: sapere che ci sono 100.000 Leucociti è una gran bella cosa, ma se non si sa se sono Neutrofili o Linfociti si rischia di scambiare una infezione con una Leucemia!

Inoltre la valutazione dello striscio consente di sapere se esiste una rigenerazione in atto ………

I vetrini degli strisci ematici dovrebbero essere fatti subito a fresco, ma possono essere fatti anche sul sangue reso incoagulabile, l’importante però è conservare il sangue in modo corretto, cioè refrigerato sino al momento dell’esame.

Un’ultima cosa importantissima: appena messo il sangue in provetta immediatamente dovete mescolate delicatamente con rotazioni ed inversioni, se aspettate anche solo pochi secondi correte due rischi:

Non tutto il sangue viene a contatto con l’anticoagulante e si creano piccoli/medi coaguli.

Soprattutto con l’EDTA l’eccesso di anticoagulante a contatto con poco sangue crea emolisi.

CONSERVAZIONE SIERO

Un sangue normale a temperatura ambiente impiega non meno di 30 minuti prima di completare il processo di coagulazione, esistono provette che contengono un acceleratore di coagulazione, ma il loro uso in veterinaria è estremamente limitato ed in ogni caso non fondamentale..

E’ consigliabile invece l’uso di provette con gel separatore per facilitare le operazioni di estrazione del siero.

E’ sempre consigliabile attendere almeno un’ora prima di procedere alla centrifugazione del campione (soprattutto con le provette senza separatore) in modo tale da consentire al sangue di “compattarsi”  completamente facilitando così la separazione del siero.

Ma si può anche decidere di centrifugare immediatamente nella consapevolezza però che molto facilmente il surnatante coagulerà ancora e che si dovrà ripetere la procedura.

Come contropartita positiva si avrà il surnatante già privo di globuli rossi perciò con meno problemi di emolisi.

Nell’estrarre il siero bisogna comunque evitare nel modo più assoluto di aspirare anche delle emazie che nel successivo probabile congelamento andrebbero naturalmente ad emolizzare causando la formazione di un siero emolitico con tutti i problemi che questo comporta e che abbiamo visto prima.

Eliminare la parte corpuscolata del sangue nel più breve tempo possibile è fondamentale se si vogliono ottenere risultati credibili per quanto riguarda la Glicemia.

Il glucosio ematico è una “brutta bestia” da gestire, oltre ad essere estremamente sensibile agli stati di stress ed alla sedazione / anestesia, è anche difficile da conservare in vitro perché le Emazie lo consumano avidamente.

A seconda degli autori si calcola che nel sangue intero diminuisca dal 7 al 12% l’ora a temperatura ambiente, questo vuol dire che una Glicemia reale di 100 dopo 8 ore può valere solo più 30 o 50 circa.

Una piccola nota conclusiva: occhio a paragonare i valori letti in Chimica liquida o secca con quelli letti dai Glucometri (in generale anche dai rifrattometri per quanto riguarda le Proteine totali) spesso e volentieri trovate differenze imponenti; sono metodi diversi che hanno Range di normalità diversi ………

Ed occhio a cosa scrivete in referto, personalmente ho visto dare al cliente un esito dove c’erano più Albumine che Proteine totali …….

TRASPORTO AL LABORATORIO

Che dire?

Se avete fatto tutto quanto scritto prima in modo preciso e puntiglioso il trasporto al Laboratorio preferito diventa uno scherzo.

SANGUE INTERO RESO INCOAGULABILE

Conservare refrigerato sino al momento del trasporto.

Sincerarsi che la provetta non si possa accidentalmente aprire (è sufficiente mettere un pezzo di cerotto che fissi il tappo alla provetta qualora non sia avvitato).

Imballare la provetta in modo tale che subisca il minor numero possibile di successioni che causano emolisi e se sono provette di vetro … rotture.

SIERO

E’ sicuramente meglio spedire il Siero già separato, quasi mai, se si spedisce senza separare, il siero che arriva è di buona qualità.

Sarebbe buona norma conservare il siero congelato sino al momento della spedizione (solo se separato dalle Emazie!).

STRISCI EMATICI

Se si decide di farli subito e si ha una buona tecnica per farlo il laboratorio vi ringrazierà perché avrà in mano un materiale sicuramente migliore come qualità.

E’ buona norma non colorarli preventivamente, ogni laboratorio ha i suoi coloranti, le sue tecniche di colorazione ed ha un “occhio” più addestrato nel leggere la propria colorazione che quella altrui.

Sarebbe opportuno usare gli appositi contenitori per il trasporto, si evitano danneggiamenti dello striscio o peggio ancora rottura dei vetrini causa una caduta accidentale (la Legge di Murphy domina sempre, più ci tenete ad un vetrino più probabilità ci sono che si rompa o si danneggi)

SIBERINI

E’ buona cosa usarli, ma non metteteli direttamente a contatto con il sangue intero (congelamento = emolisi) e se trasportate anche vetrini avvolgete quest’ultimi con un imballaggio impermeabile, i vetrini non amano l’umidità …….

SCOPI E LIMITI DI UN ESAME DEL SANGUE

PERCHE’ FARE UN ESAME DEL SANGUE

Diciamolo subito chiaramente: l’esame del sangue è un mezzo diagnostico e non una diagnosi.

Quando si perde di vista questo concetto ci si mette nelle condizioni di trovarsi nei guai.

Il punto fondamentale per una buona diagnosi è e rimane sempre una buona visita clinica del paziente che poi può (mi spingo a dire deve) essere integrata da accertamenti collaterali: l’esame del sangue è uno di questi accertamenti al pari ad esempio degli accertamenti radiografici

Facciamo ancora attenzione ad una cosa: qualsiasi accertamento collaterale alla visita è utile e si integra con gli altri perché fornisce informazioni, ma mai e poi mai un tipo di accertamento può prendere il posto di un altro.

Talvolta l’esame del sangue è il più importante, qualche volta no, anche se resta sempre e comunque utile: il perché lo vedremo a breve.

A COSA SERVE UN ESAME DEL SANGUE

Le possibili funzioni che può avere un esame del sangue sono molteplici, ma credo che possano essere riassunte in queste quattro.

aiuta nella ricerca di una diagnosi

fornisce notizie sulla gravità della malattia

dà informazioni sulla prognosi

consente di valutare la risposta alle terapie effettuate

E’ del tutto intuitivo che per quanto riguarda i primi tre punti è sufficiente un solo prelievo (che spesso viene effettuato in condizioni di urgenza), mentre il discorso si fa un po’ più complesso quando si passa al quarto punto.

Infatti in questo caso quello che dobbiamo cercare non è la “fotografia” di una situazione clinica, ma il modo migliore per ottenere un “filmato” dell’evoluzione della patologia in atto.

E la prima cosa che si deve ricercare in questo caso è la standardizzazione delle procedure di prelievo, conservazione e trasporto del sangue al laboratorio di fiducia.

LIMITI OGGETTIVI DI UN ESAME DEL SANGUE

Sono moltissimi, tanto che talvolta verrebbe da pensa che ottenere un risultato congruo alle aspettative sia frutto più del caso che della scienza, ma in realtà esistono metodi ed approcci nella lettura dei referti che consentono di ridurre al minimo il margine di errore..

Attenzione, ho detto ridurre al minimo, non eliminare l’errore.

Per ottenere ciò bisogna però conoscere alcuni concetti di base, che generalmente sono quelli che tutti saltano a piè pari.

RANGE DI NORMALITA’

Lungi da me l’idea di tediarvi con curve Gaussiane o logaritmi in base 10, credo che non ve ne possa fregare di meno ed in ogni caso non è compito di chi richiede un esame conoscere queste cose, quello che mi preme invece far comprendere è che è molto improbabile che due laboratori diversi abbiano gli stessi range di normalità.

E da questo concetto discende direttamente il primo punto fondamentale:

MAI CONFRONTARE ESITI DI LABORATORIO  PROVENIENTI DA POSTI DIVERSI SENZA FARE RIFERIMENTO ALL’INTERVALLO DI NORMALITA’ CHE QUESTI HANNO.

E mi spiego meglio con un esempio: il valore numerico 100 per una Transaminasi è normale se il range di un laboratorio è 60-120, mentre risulta essere patologico per un altro laboratorio il cui range di normalità è 25-80.

Uno dei due laboratori ha sbagliato qualcosa? Quasi sicuramente no, semplicemente forse uno lavora a 37° l’altro a 25°.

Quindi se ripetete gli esami di un paziente  a distanza di 2-3 giorni in due posti diversi ed entrambi vi danno come valore numerico 100 non vuol dire che il soggetto esaminato sia stabile, anzi esattamente l’opposto.

Il secondo punto fondamentale è perciò questo:

NON FATE MAI AFFIDAMENTO SUI VALORI NORMALI CHE TROVATE NEI LIBRI, VALGONO SOLO SE VI RIVOLGETE AL LABORATORIO DI CHI HA FATTO IL LIBRO.

Terzo ed ultimo punto fondamentale:

UN ESITO DI LABORATORIO CHE NON FA RIFERIMENTO A DEI VALORI NORMALI E’ ….. INUTILE.

E se ne vedono tanti …...

CONCETTO DI NORMALITA’

NON ESISTE UN VALORE DI NORMALITA’ CHE SIA ASSOLUTO, O PER MEGLIO DIRE OGNI ESSERE VIVENTE HA IL PROPRIO.

E’ del tutto evidente che questo è materialmente impossibile ottenerlo, visto che per lo meno si dovrebbero avere 120 esami del soggetto in salute per poterli ricavare.

Quindi in ogni caso quello che si ottiene come “NORMALITA’” è un compromesso che si ottiene confrontando fra loro soggetti simili.

In campo umano le cose sono estremamente più semplici, fondamentalmente le differenze vengono fatte fra uomini, donne e bambini (ma credo che entro breve dovranno cominciare a farle all’interno delle razze e questo non per razzismo!).

Noi Veterinari dobbiamo farle fra speci diverse ed all’interno delle speci fra razze diverse, maschi, femmine, castrati, cuccioli, adulti ……

E’ MATERIALMENTE IMPOSSIBILE RICAVARE TUTTI I VALORI NORMALI A SECONDA DI TUTTE LE VARIANTI POSSIBILI.

Nemmeno i più grandi laboratori al mondo sono in grado di farlo, dobbiamo perciò essere noi veterinari pratici a supplire a questa carenza obiettiva usando la testa quando guardiamo degli esiti.di laboratorio.

Il solito esempio (con numeri messi a caso) che serve a chiarire il concetto.

Range di normalità della Creatinina del cane 0,5—1,5

Valore determinato dall’analisi 1,5

Se l’esaminato è un cucciolo il valore è patologico.

Se l’esaminato è un soggetto di piccola taglia adulto è border line

Se l’esaminato è un soggetto di grossa taglia adulto è normale.

Se poi l’esaminato è un soggetto adulto  di media taglia , ma ostruito il valore è patologico in quanto tale, ma normale se consideriamo la patologia in atto.

Di fondo a chi esegue l’esame non interessa molto avere tante informazioni del soggetto esaminato, mentre queste cose sono di fondamentale importanza per chi deve interpretare l’esito.

A maggior ragione se teniamo conto del fatto che non siamo i fruitori finali della interpretazione, ma che le nostre elucubrazioni mentali dobbiamo andarle a spiegare ad un proprietario che quasi sempre ne sa meno di noi, ma è abilissimo nel comprendere se stiamo parlando con ragione di causa o se siamo i primi a non capirne nulla …..

CONCETTO DI SPECIFICITA’ E SENSIBILITA’

E’ un concetto di fondamentale importanza valido per qualsiasi tipo di esame (e mi riferisco perciò anche agli SNAPS che sempre più spesso vengono usati nei nostri ambulatori).

Quando eseguiamo un esame dobbiamo essere in grado di distinguere fra 4 possibili esiti:

Veri positivi (malati alla visita e per gli esami)

Veri negativi (sani alla visita e per gli esami)

Falsi positivi (sani alla visita e malati per gli esami)

Falsi negativi (malati alla visita e sani per gli esami)

I nostri esami devono perciò essere:

SENSIBILI

Devono cioè essere in grado di scovare all’interno di una popolazione il maggior numero possibile di malati in altre parole devono scovare il maggior numero possibile di Veri positivi, ma anche il maggior numero di Falsi negativi.

Ma devono anche essere:

SPECIFICI

Devono cioè essere in grado di scovare all’interno di una popolazione solo i soggetti realmente malati, cioè devono essere in grado di individuare non solo i Veri negativi, ma anche i Falsi positivi.

In realtà non è possibile ottenere tutto questo, così come non è possibile avere la moglie ubriaca e la botte piena.

E ritorniamo di nuovo al punto di prima: quello che otteniamo è sempre e solo un compromesso fra tutte le variabili viste qui sopra.

Ma qui quasi sempre abbiamo una possibilità che ci aiuta non poco: non basarsi su un solo analita, ma su un pacchetto di analisi.

In realtà spesso è quello che forse inconsapevolmente facciamo quando non ci accontentiamo di uno SNAP positivo o negativo, ma chiediamo anche un Protidogramma elettroforetico.

Il ruolo del laboratorio in questo caso può diventare estremamente importante perché spostando il range di normalità in senso positivo o negativo il laboratorio è in grado di restringere o allargare il limite di errore.

Esistono regole ben precise per porre questi limiti, ma penso che sia utile che i Veterinari pratici conoscano queste cose, perché quello che qualsiasi laboratorio può fornire non è mai la verità, ma ciò che più di tutto gli si avvicina.

DOVE POSIZIONARE LA NORMALITA’

Come già detto esistono regole ben precise per farlo e che devono essere rispettate, quello che qui mi preme sottolineare è che qualsiasi sia il risultato che si ottiene esiste sempre e comunque un margine di imponderatezza che il veterinario pratico deve conoscere.

In pratica esiste un modo di procedere che vediamo di approfondire con il solito esempio numerico di mera fantasia.

Abbiamo raccolto i nostri 120 campioni da soggetti ritenuti sani alla visita clinica, abbiamo fatto i calcoli di rito ed adesso sappiamo che il valore “normale” è compreso fra 10 e 100.

Ebbene, magicamente già i 3 risultati più alti ed i 3 risultati più bassi che avevamo ricavato sono fuori dalla normalità!

Ecco che adesso riusciamo a comprendere meglio il termine Falso positivo visto prima.

Ma possiamo fare di meglio: analizziamo altri 120 campioni provenienti da soggetti sicuramente malati, ebbene, altrettanto sicuramente, ne troveremo un certo numero che cadrà nel range di normalità.

E questi sono i Falsi negativi visti prima.

ESISTE PERCIO’ A CAVALLO DEL RANGE DI NORMALITA’ UNA FASCIA DI RISULTATI DOVE POSITIVO E NEGATIVO (SANO E MALATO) SI CONFONDONO.

Da questo discende però anche un’altra importantissima cosa e cioè che se arbitrariamente portiamo il valore normale massimo da 100 a 110 sicuramente avremo centrato l’obiettivo di conoscere per certo TUTTI i Veri negativi, ma contemporaneamente avremo aumentato la fascia dei Falsi negativi.

Al contrario se abbassiamo il valore da 100 a 90 sicuramente NON avremo più Falsi negativi, ma avremo aumentato il numero dei Falsi positivi.

Qualsiasi risultato che sia a stretto contatto con i limiti dei range di normalità deve perciò essere valutato attentamente e non può essere dissociato da una buona visita clinica fatta con tutta la scienza e la coscienza di cui siamo capaci.

ARTEFATTI IN LABORATORIO

Per artefatto si intende una qualsiasi causa in grado di poter alterare il reale valore dell’analita considerato.

Possiamo distinguere una vasta gamma di artefatti:

artefatti pre analitici

errori di prelievo

materiale di consumo non idoneo

errata scelta dell’anticoagulante

errori di conservazione del campione

temperatura non idonea

ritardo nell’invio al laboratorio

errori di preparazione del paziente

mancato digiuno

ambiente non idoneo

sostanze interferenti

disinfettanti

medicinali somministrati

artefatti in fase di analisi

errori di preparazione dei reagenti

errori di preparazione del campione

errori dovuti allo strumento in uso

artefatti post analitici

errata refertazione

paziente sbagliato

imprecisioni nella trascrizione del risultato

Emolisi, lipemia ed ittero sono la principale causa di artefatti in fase analitica